凋亡or焦亡相关wb怎么做❓（以caspase3为例）

✨今日分享：做与细胞死亡相关的western需要注意的问题～例如凋亡，焦亡，从制样到跑电泳的tips都在这里啦，码住码住！[吧唧R] 相关的很多蛋白都类似，分为总带和切割带，被激活以后出现切割带进而发挥功能…以caspase3为例，分享下经验。[kissR] ➡️首先：caspase3的孵育案例，大概情况分为P2，P3两种，不要裁膜做，建议总带和切割带一起发光。 ➡️其次：caspase3切割带有两条，P17和P19，P17更明显，切割带丰度越高，凋亡越多，切割带与内参进行比较，而不是和总带比较❗️ ➡️最后：如果只孵育cle-cas3也是可以的！我一般是一起孵育，作图时总带和切割带都会展示。 🌟用的Abmart家的caspase3，挺好用的，用我们实验室的发光液，总带几秒曝出，切割带20几秒曝出，背景干净，结果也比较稳定～货号：T40044，这款有试用，做这个蛋白的宝可以找领取❗️[举手R] 以下是实验操作tips～ ✅1、制样 这种激活性质的蛋白通常降解较快，因此裂解液要严格添加蛋白酶抑制剂，全程冰上操作，不要抱有侥幸心理，样品制好后涡炫分装冻负80，收细胞时要收集上清然后一起离心，醉好是新鲜蛋白新鲜跑！ ✅2、跑电泳上样量 每孔不低于30ug，caspase3的切割带相对于其他蛋白来说含量较低，因此要保证足够的蛋白丰度。 ✅3、胶的选择 相关蛋白很多都是小分子，建议选择大于12%的胶，13.5%和15%都可以，35kd和15kd要分的开一些，更容易出结果，目的条带不要离loading带太近，另外，caspase3不推荐用预制胶。 ✅4、电泳和转膜条件 小分子蛋白推荐用0.22的pvdf膜，不用担心转过，小分子大分子可以一起转～ 如果要用0.45的膜转小分子蛋白，理论上1KD转1min，再比理论上多10min即可，转太久容易丢失蛋白信号。 （封闭正常封闭即可，封闭完可以洗10min再敷一抗） ✅5、 一抗孵育 4度过夜孵育效果比室温好，最短9小时，个人认为室温孵育只适合内参和标签抗体，P2P3用的Abmart的caspase3过夜4度孵育，稀释比例1：1000。