731部队并不是日本最残忍的生化部队，真正日本最残忍的生化部队还属于516部队，即便在新中国成立几十年后，516部队当初遗留下来的化学武器还对很多中国人造成了伤害和死亡。 516部队最初直接隶属于日本关东军化学部，而日本关东军化学部名义上归属于关东军，实际上却是归日本陆军司令部直接管辖，属于是日本陆军司令部专门设在中国的化学战研究、训练机构。 1939年516部队独立出来，设立部队番号为满洲第五一六部队，其部队基地最初设在黑龙江省齐齐哈尔市，在黑龙江佳木斯市设有秘密毒气、细菌研究基地和秘密监狱，在佳木斯516部队经常秘密掳走一些中国平民，关入秘密监狱，将他们变成实验对象，后来516部队基地又前往吉林省长春市。 根据曾在516部队服役的战犯在后来交代，516部队从事的工作性质在日本陆军内部都是十分保密，并且部队内部成员之间都不能随意往来，部队成员只能负责上面交代给自己的任务。 而且516部队的所有成员在加入这支部队前必须进行日本军国主义特殊训练，要严格宣誓效忠天皇为大日本崛起牺牲一切。 516部队残忍的地方是他们不仅对中国人残忍，对自己部队成员训练也很残忍，新加入516部队的成员不仅要通过教材了解各种毒气，还要亲身体验各种毒气，516部队的训练人员会强迫把新成员关在密闭教室中体验各种毒气。 由于一战后国际上已经出台限制各国使用生化武器的国际法，因此日本为了隐藏自己的生化武器，对516部队、731部队等生化部队极为保密。 在侵华期间，日军都是把516部队研发的生化毒气配置在迫击炮部队中，用迫击炮发射带有毒气的炮弹，对中国抗日军民造成了极大伤害。 根据516部队战犯交代，在1940年时，日军在辽宁新民县辽河左岸附近进行腐烂性瓦斯毒气实战演习，当场造成两名附近正在劳作的中国农民死亡和100多只羊死亡，并且这场演习对周围48万平米土地造成污染，这些土地一年内都不能再使用，后续还有不少附近村民因此致残或致死。 同年7月，516部队还在黑龙江富拉尔基一带散布了近2000平米100公斤的毒气，致使当地5名无辜中国平民死亡和25名平民致残。 从1939年到1945年日本投降，516部队在中国东北三省进行毒气实验和实战演习，至少害死了近千名中国无辜平民，致残人数则更多。 而且随着日军侵华的深入，516部队的秘密制毒基地也越来越多，先后在中国沈阳、武汉、太原、南京、广州等大城市设立秘密制毒基地和生化武器装配工厂。 据权威资料统计，日本从全面侵华战争开始，先后在中国14个省市、77个县区使用生化武器1731次，造成中国军民伤亡36968人，其中致死2086人，而这个伤亡人数是二战后国民政府统计出来，实际致死人数应该比国民政府统计的还要高得多。 日军不仅对中国人使用这些生化武器，还猖狂的在菲律宾对美军也使用了这些生化武器，这也激怒了时任美国总统罗斯福。 1942年7月，罗斯福在全世界发布公开声明称：“日军如果再继续对中国或其他国家使用生化武器，那么美国政府将认为这是针对美国所为，将对日本实施同样的报复。” 其实在二战期间，美国的生化战能力远超日本，即便日本在中国各大城市开设制毒基地和装配工厂，其生化武器产量和杀伤力都远远落后于美国，因此日本被罗斯福的声明吓住了，从1942年之后才开始逐渐减少对中国生化武器使用，直到1944年日本陆军司令部停止生化武器研发并撤回所有生化武器。 随着日本战败投降，日本撤离中国，其留在中国的大部分生化武器被苏联红军和美军销毁，但依然还有大量生化武器遗留在中国。 据统计，日本遗留在中国的生化武器可分为四大类和十余种类，共计230万件化学武器和120吨化学毒剂。 这些东西在战后对中国人民又造成了很大伤害，国家为此不得已对已探明存有生化武器的地方划分为禁区，但在上个世纪七八十年代，还有不少无辜的中国平民因误入禁区或进入未探明存有生化武器的地方致死或致残。 所以相比于731部队在侵华战争时对中国人民残忍的伤害，516部队虽然没有731部队对中国人造成的伤害那么残忍那么大，但516部队留给中国人民的伤害是长时间的，后劲伤害要远比731部队大得多。
